虾夷扇贝组织结构分析【库百科养殖网】

虾夷扇贝组织结构分析

把虾夷扇贝作为实验材料，掌握虾夷扇贝血涂片的制作方法，并运用HE染色组织切片的方法对虾夷扇贝的组织结构进行观察以及分析。用5 mL注射器吸取2 mL肝素钠，抽取1 mL左右虾夷扇贝心脏血液，从载玻片一端滴一滴血液，左手水平拿着玻片，右手用另一个载玻片水平轻推血液，使其展平，在阴凉处风干，同样方法制取五个血涂片。留一个做空白对照，取两个血涂片用瑞氏染液染色，其他两个吉姆萨染液染色，放于阴凉处晾干留作观察。取新鲜扇贝组织切成1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的组织块，经过固定、脱水与透明、浸蜡、包埋等过程后把组织块切成4～6μm的石蜡切片。再经过苏木素染色盐酸酒精褪色，后用伊红染液复染等过程后用中性树胶完成封片，待干后进行显微镜的观察以及拍照。最后通过观察与人体以及鱼类相关的组织结构进行分析对比。关键词：虾夷扇贝;血涂片;苏木素-伊红染色法;组织结构分析虾夷扇贝于1982年引进我国[1]。其原产于日本、俄罗斯千岛群岛等地，主要分布于盐度较高，底质硬，淤沙少且水深不超过40 m的沿岸海区[2]。后引进我国，主要养殖区域集中在辽东半岛、山东长岛等海区，生长速度较慢。虾夷扇贝是近些年来贝类水产品的主要生产品种，其内含有大量蛋白质、EPA、DHA等对人体有益的成分[3]。具有相当高的营养经济价值。并且因为虾夷扇贝漂亮的外形，在我国南方将其称为“圆贝”，其圆满的造型象征着团聚、美满，雌雄半壳贝作为“鸳鸯喜贝”经常被搭配摆上婚宴餐桌，代表着对新人的祝福;同时虾夷半壳贝圆满的造型还是中秋佳节一家人团聚时候必不可少的美味佳肴，代表着团圆美好。 虾夷扇贝由我国引入后，进行了较为成功的人工育苗和养殖试验。现如今虾夷扇贝在我国的大规模人工养殖和增殖也主要集中于辽宁、山东等北方沿海地区，并且养殖面积已经达到了10万平方公里[4]。在2011年，我国虾夷扇贝产量达到1.3×106 t。辽宁大连的獐子岛，因为其地理位置以及气候环境等因素达到虾夷扇贝成长所必须的要求，近年已经发展成为国内最大的虾夷扇贝底播养殖基地，现已发展成为2 000多平方公里的海洋牧场。大连海洋岛虾夷扇贝生产基地也是因其含有虾夷扇贝生长必须的营养盐，并且海水的理化因子稳定，周年稳定的水温，以及良好的水源环境和合适的盐度发展成为了最为适宜虾夷扇贝生长的理想之地。当地成熟虾夷扇贝个体大、贝柱肥、肉质细、颗粒饱满从而使海洋岛虾夷扇贝享誉国内外[5]。但是近年来随着虾夷扇贝养殖规模的不断变大、扇贝品种、环境、病害的问题，并且伴因为连续多代的人工繁殖，虾夷扇贝的群体内出现了近亲杂交现象，因此虾夷扇贝的养殖环境以及生长条件发生了剧变，导致近年的虾夷扇贝各种问题，所以对虾夷扇贝的观察与组织结构分析就显得尤为重要[6]。 本次实验利用血涂片的制作以及常规的组织切片、苏木素-伊红染色（HE染色）的方法，更加细致直观的对虾夷扇贝的组织器官细胞进行观察以及分析，并且通过和鱼类、哺乳动物同类别的组织细胞进行对比，了解其组织器官的特性，加深对虾夷扇贝的了解。掌握这种方法也可以运用此种方法对其他动物组织进行试验，更加精确的反应一个生物的组织结构。1实验材料及方法1.1实验材料1.1.1实验器材5 mL注射器、1 mL注射器、1 000 mL试剂瓶、500 mL试剂瓶、纱布、镊子、剪刀、电炉、洗衣粉、250 mL试剂瓶、染色缸、染色架、切片机、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片、烘箱。1.1.2实验药品瑞氏染色试剂盒、苦味酸、碘酸钠、明矾、95%乙醇、石蜡、氨水、柠檬酸、甘油、冰醋酸、盐酸羟胺、苏木素、伊红、钾明矾、中性树胶、二甲苯、100%乙醇、盐酸。1.1.3实验对象虾夷扇贝（市场购得）。1.2实验方法1.2.1药品配制 波恩氏液：苦味酸饱和水溶液75 mL、冰醋酸5 mL以及甲醛溶液25 mL，三者充分互溶，此液体必须现用现配，用作组织固定液。 苏木素液[7]：用1 000 mL蒸馏水将0.2 g碘酸钠加温到100 ℃溶解后加入1g苏木素，使其呈现深樱桃红色，再加50 g明矾，使溶液变为蓝紫色，再继续加热煮沸，大约5 min过后加入50 g水合氯醛，并且搅拌，使液体变为紫红色，溶解完成后加入1g的柠檬酸，冷却过滤后备用。该液体可以长时间的保存，若陈液水分蒸发，可以加入适量的2%钾矾液稀释即可。 伊红：为了使实验效果更好本次配制的伊红染液为醇溶性伊红，取伊红2.5 g加入蒸馏水（少许）慢慢搅动，再加入95%的酒精500 mL，在加入酒精的过程中要不停的搅拌，直到彻底溶解。此时的试剂有些浑浊，可取少量的冰醋酸加入到试剂中，试剂会逐渐变得澄澈，并且试剂颜色变为鲜红色。1.2.2外部形态观察从实验所用的虾夷扇贝中选取个体较大，结构较为清晰，没有明显伤痕的扇贝，进行初步的外形观察：虾夷扇贝的外形呈标准的扇形，像一把打开的扇子，外形十分漂亮。观察可见其壳顶位于中央、等侧，并且壳顶两侧的壳耳大小相等，十分对称。并且右壳的前耳有足丝孔。对贝壳的表面进行观察可见贝壳的表面有15～20条放射肋，右壳的肋比较宽大短小，肋之间较为狭窄;左壳肋较细，肋间较宽有的有网目雕刻。右壳较左壳相对大些，并且呈现出黄白色，比较突出。而左壳相对平整，一般呈现紫褐色。壳内面为浅白色，位于壳顶下方的内韧带呈倒三角，虾夷扇贝为单柱类，其闭壳肌大，在壳的中后部[8]。1.2.3血涂片制作选用5 mL的注射器抽取肝素钠2 mL，再从虾夷扇贝的心脏中抽取1 mL左右血液，从载玻片的一端滴一滴扇贝血液，左手拿玻片保持玻片水平，右手用另一个载玻片水平的轻轻将血液展平，置于阴凉处晾干，用相同方法制作五个血涂片。取其中两个用瑞氏染液染色，再取两个用吉姆萨染液染色，放于阴凉处晾干，清洗，留做后续观察。1.2.4组织切片的制作玻片处理：取新载玻片置于大烧杯中，加洗衣粉适量以水使其能够没过载玻片，在电炉上加热煮沸15～20 min，流水冲洗，用滤纸擦干后使用。取材：取材所用的组织应该保证新鲜，这样才可以保证其原有的形态学结构，保证实验的准确性。选取的组织尽量保证能够切取的体积为1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，以便能够使固定液较为充分的渗入组织内部，达到较好的固定作用。在切取组织的时候一定要保证刀具的锋利，切勿因为夹取组织过于用力使组织被挤压变形，影响最终实验品质。再有还要根据组织器官的结构选择合适的切面走向，同时要保证组织器官的清洁，如果组织表面有血渍、污物等要及时的用水冲洗，保证放入固定液之前组织的干净，实验过程每一步都要用滤纸擦干吸干组织表面然后再进行下一步。固定后的组织多少会有些许变形，此时要尽可能的将组织展开放平保证组织的外形和切取之前一致，以便于观察对比[9]。固定：把切好的组织块分别包裹于纱布中，放入固定液中，保持24 h以上，然后进行修块，使组织维持在1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，组织块尽量的规整，修剪结束后再放入固定液中，继续固定6到7 h。清洗：将固定完成的组织块连同纱布一起放于大烧杯中，烧杯略倾斜，并且在烧杯口上盖上纱布，用小水流进行冲洗，大概冲洗24 h左右。清洗用以清洗去除组织中的固定液，防止固定液影响染色过程。脱水与透明：组织块经过固定清洗后还含有较多的水分，含有水分过多不便于后面浸蜡，只有通过酒精灯溶剂置换出水分后，使组织变硬，才能够为后续的实验做好铺垫。脱水的过程可能会使组织强烈收缩，致使组织变形如果太过着急。一般脱水使用的试剂为不同浓度的酒精。具体的操作步骤为：将组织块逐步移入70%酒精，80%酒精，90%酒精，95%酒精中各浸泡4 h，然后将组织块浸入100%酒精Ⅰ、Ⅱ各2 h，用滤纸吸干后再浸泡于无水酒精和二甲苯1∶1的混合液中10 min，再于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡20 min，因为酒精不能与石蜡混合，所以必须用二甲苯替换出酒精。浸蜡：浸蜡之前要把石蜡融化，应该提前8 h把石蜡放入60 ℃的烘箱中，反复2次，留作后用。把组织块置于60 ℃的烘箱中浸蜡，浸蜡时间为3 h，否则组织块会发脆，易损坏。浸蜡的主要目的是把二甲苯从组织块中替换出来，以便石蜡浸入组织后使组织变硬能够顺利的切成薄片。包埋：取牛皮纸，折成小盒状并做好标记，先倒入熔好的石蜡，将浸蜡的组织块分别取出后置入小盒中，石蜡完全凝固后组织被包埋在其中，这一过程称为包埋，形成的小块叫做蜡块，该蜡块可以长久的保存。切片：切片前必须修蜡块，依据组织的大小把组织边缘0.1～0.2 cm处切去蜡块的多余部分，否则过多余的蜡块会造成组织的褶皱不平。事先准备好切片刀、毛笔、镊子、烘箱，把蜡块安装在木质的持蜡器上。安装好蜡块之后再安装切片刀，确保自己的安全，在切片机的刀台上装好刀片，旋紧紧固螺丝，保证切片刀在切片过程正不晃动，使切片更加均匀。后再调节切片机的厚度调节器，厚度设定为4～6 μm。用镊子将切好的蜡带轻轻的铺平，放置在42 ℃的水面上进行展片，等到蜡片充分的展开后将蜡片拉到载玻片的中间并且倾斜载玻片去除玻片上的水。然后将玻片放在60 ℃的烘箱中烤片3 h，脱去组织间的石蜡，使组织与玻片结合紧密。染色和封片[10]：从烘箱中取出玻片于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡10 min，擦干后再移入100%、95%、90%、80%、70%的酒精中各2 min，后再放入蒸馏水中2 min，之后再放在苏木素溶液中染色7～10 min，用滤纸擦干后再放入盐酸酒精中焯一下反复三次，最后用自来水小水流冲洗20 min。冲洗后的玻片再置于伊红染液中染色7～10 min，再分别在70%，80%，90%的酒精中各洗三下，擦干后于95%的酒精Ⅰ、Ⅱ，100%酒精Ⅰ、Ⅱ中各5 min，后置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10 min，最后用中性树胶进行封片，晾干了之后进行显微镜的镜检和照相。2结果与分析2.1实验照片 虾夷扇贝血与草鱼血涂片：虾夷扇贝血细胞与草鱼血细胞对比见图1和图2。图1虾夷扇贝血涂片图2草鱼血涂片 虾夷扇贝鳃：虾夷扇贝的鳃是呼吸系统的重要组成部分，其在内脏团的两侧，外观为新月形，鳃丝与鳃丝之间由纤毛相结合组成纤毛盘，在下行鳃板的下部和相对的上行鳃板的部分由结缔组织相连。图3虾夷扇贝鳃 虾夷扇贝外套膜：虾夷扇贝外套膜的镜检照片中可以看出外套膜分为三层，外层为较薄的一层，中层比较厚，并且具有发达的触手和外套眼，外套眼在触手之间呈现出深黑色，最内一层最为发达被称为帆状部，边缘上有一排小触手（见图4）。图4虾夷扇贝外套膜 虾夷扇贝肠：虾夷扇贝的肠可以分为直肠、上行肠、下行肠共三段。下行肠自胃的腹面近中后部的位置，沿着生殖腺后面边缘抵达生殖腺的末端，再沿着后端边缘转弯上行，转入上行肠。下行肠的肠腔中有一条晶杆，晶杆在消化管中的位置与稍高等类型不同，扇贝晶杆在肠腔当中，并不是单独存在（见图5）。图5虾夷扇贝肠2.2分析2.2.1虾夷扇贝血细胞与草鱼血细胞对比虾夷扇贝的血液呈浅蓝色，并不是一般动物所呈现的红色，因为其所含血细胞中主要为血蓝蛋白。虾夷扇贝的血细胞中无明显细胞质;而草鱼的血细胞中包括红细胞和白细胞，其中白细胞又含有淋巴细胞、单核细胞、嗜中性细胞、嗜碱性粒细胞以及血栓细胞等，草鱼的血细胞中不含有血小板，不过白细胞中含有血栓细胞能够起到与血小板相同的凝血作用。2.2.2虾夷扇贝鳃与草鱼鳃对比虾夷扇贝的鳃左右各一呈新月形，位于内脏团的两侧，前段从唇瓣的末端开始，一直延伸到肛门后方。鱼类的鳃由咽部后端两侧发生。构成相对复杂，胚胎期咽头内胚层形成一对鳃笼，向外侧伸展，向中胚层发展，正对鳃笼的外胚层向内陷入成为鳃沟，后继续发展形成鳃裂，咽头内腔与外界相通[12]。2.2.3虾夷扇贝肠与草鱼肠对比虾夷扇贝的肠划分为上行肠、下行肠以及直肠。下行肠出自胃的腹面中后部，从消化腺中传出来并插入生殖腺中，开始的部分呈囊行相对较宽，后面收缩向生殖腺的后面边缘延伸斜下抵达生殖腺末端，再沿着后端边缘向上转入上行肠。而草鱼的肠内表面多褶皱，并内壁附有小肠绒毛，增加消化吸收的表面积。2.2.4虾夷扇贝肠与人类肠道对比虾夷扇贝的肠道与人类的肠道有很大的不同，人类的肠道内壁多褶皱并附有小肠绒毛，小肠绒毛中含有毛细血管以及毛细淋巴管，便于营养物质吸收，并且人体肠道内含有多种消化酶。3讨论 染色所用的伊红染液可以在配制过程中选用伊红水溶液，这样制备相对简单，只需要用伊红加入水中充分溶解，质量不好可以加入少量的冰醋酸。对此种方法配制的伊红溶液与伊红醇溶液相比后者相对质量较好，所以实验过程中要尽可能的选取对实验有利的方法。 实验操作相对不够熟练，处理血涂片的过程中出现了血液铺展不平，造成了血液堆积，对后续的观察以及最终的实验结果造成了较大的影响，对实验品质造成了不好的结果。并且在切片过程中对切片机的使用不够熟练以及蜡片品质不佳，切出的蜡片不够均匀。 实验准备工作要做好，防止实验过程中因为准备不充分影响试验进度或者实验最终品质，并且实验操作人员也要做好充足的准备，保证实验的操作正确性，规范性。参考文献：[1] 王庆成.虾夷扇贝的引进及在我国北方增养殖前景[J].水产科学，1984，3（4）：24-27