撰文/西风吹行客

编辑/西风吹行客

（百慕大草）

前言

百慕大草（Cynodon dactylon L.）是一种重要的暖季草坪草品种，匍匐生长发育良好，为百慕大草植物通过无性克隆生长快速繁殖奠定了基础。然而，百慕大草匍匐的生长发育在分子水平上仍然知之甚少。

我们本次的研究将全面分析百慕大草品种阳江速生匍匐中蛋白质的乙酰化和琥珀酰化修饰。

并采用液相色谱-串联质谱联用法分别成功鉴定了4657种蛋白质上的1914个赖氨酸乙酰化位点和226种蛋白质上的128个赖氨酸琥珀酰化位点。

此外，我们还发现了78种蛋白质和81个赖氨酸位点同时被乙酰化和琥珀酰化。功能富集分析表明，乙酰化蛋白调节碳水化合物代谢和蛋白质周转的不同反应，而琥珀酰化蛋白主要调节柠檬酸盐循环。

这些研究结果部分解释了丁酸钠和丙二酸钠处理下百慕大草匍匐茎的不同生长障碍，它们分别干扰蛋白质乙酰化和琥珀酰化。

此外，还有140种乙酰化蛋白和42种琥珀酰化蛋白在其他草种中具有类似修饰的直系同源物。

研究中位点特异性突变结合酶活性测定表明，过氧化氢酶的保守乙酰化和苹果酸脱氢酶的琥珀酰化均抑制了它们的活性，进一步暗示了两种修饰的重要调控作用。

百慕大草的生长环境和繁殖特点

百慕大草（Cynodon dactylon L.）作为一种具有巨大经济价值的多年生暖季草坪草种，广泛用于世界各地温暖地区的公园、高尔夫球场、运动场和家庭草坪的草坪种植。

与水稻、小麦、玉米、高粱和大麦等驯化谷类草不同，百慕大草植物通常通过从斯托隆节点克隆再生幼苗进行无性繁殖。

凭借这种繁殖特性，百慕大草可以通过不断生成和再生匍匐，在空旷的地方快速传播，为百慕大草的草坪型品种形成均匀美观的草坪奠定了基础。

在过去的几年中，高通量转录组学和蛋白质组学研究揭示了代谢调节在百慕大草匍匐生长中的特化和匍匐生长中的关键作用。

例如，比较转录组分析表明，与直立生长的野生种质相比，木质素生物合成在匍匐生长的野生种质中受到损害。比较蛋白质组学和酶分析表明，匍匐在匍匐中淀粉积累高度活跃，而在芽中糖酵解活性更为突出。

与地下生长的匍匐茎相比，地上生长的匍匐茎具有大量的叶绿素和参与光合作用的酶的高表达，这表明匍匐茎可能起到额外的光合器官的作用。然而，调节百慕大草不同代谢反应的详细分子机制仍然知之甚少。

在目前的研究中，我们对快速生长的百慕大草匍匐中的蛋白质赖氨酸乙酰化和琥珀酰化修饰进行了全局鉴定。共鉴定了4657种蛋白质上的1914个赖氨酸乙酰化位点和226种蛋白质上的128个赖氨酸琥珀酰化位点。

系统分析了两种PTM在速生百慕大草匍匐茎中的特性和功能，并评价了两种PTM对关键酶活性的影响。

这项研究的结果不仅首次全面了解草坪草的乙酰素和琥珀素，而且扩展了对快速生长植物器官代谢调节的理解。

干扰蛋白质赖氨酸乙酰化调节百慕大草的生长

百慕大草是一种暖季草坪草，具有多种应用。通过匍匐生长的快速生长和不断分化，百慕大草植物可以无性繁殖。

在过去的几年中，已经发现许多外源小分子在正常和胁迫条件下影响百慕大草植物的生长和发育。

褪黑激素也被发现可以缓解H2O2-调节百慕大草中的植物生长、细胞损伤和活性氧积累。此外，蛋白磷酸酶抑制剂NaF和蛋白激酶抑制剂星形孢菌素均抑制百慕大草的正常生长和淀粉积累。

在这项研究中，还观察到组蛋白脱乙酰酶抑制剂丁酸钠和琥珀酸脱氢酶抑制剂丙二酸钠调节百慕大草植物的生长，尤其是匍匐动物。

有趣的是，两种盐在低浓度（10 mM）下促进匍匐生长，但在高浓度（50 mM）下抑制匍匐生长，这与高浓度丙二酸对拟南芥幼苗生长的毒性作用一致。

此外，丁酸钠同时影响可溶性糖和蛋白质含量，而丙二酸钠对可溶性蛋白质含量影响不大。

由于百慕大草品种阳江是一种耐盐品种，在50 mM NaCl处理下保持正常生长，这些结果表明丁酸钠和丙二酸钠在调节百慕大草匍匐生长方面的功能不同，可能分别通过调节必需蛋白质的乙酰化和琥珀酰化修饰。

琥珀酰化修饰

我们已经在不同的植物物种中进行了乙酰体和琥珀酰体分析实验。在这些研究中，纸桑中鉴定出多达3179种乙酰化蛋白，而据报道，水稻和草莓中琥珀酰化蛋白的最大和最小数量分别为2593种和116种。

在这项研究中，在快速生长的百慕大草匍匐中成功鉴定了1914种乙酰化蛋白和128种琥珀酰化蛋白。

值得注意的是，琥珀酰化蛋白的数量远低于乙酰化蛋白的数量。

尽管两种PTM的免疫亲和富集效率可能不同，从而导致两种鉴定结果之间存在差异，但考虑到纸桑树中鉴定的琥珀酰化蛋白数量也远低于乙酰化蛋白，因此不能排除两种PTM在百慕大草匍匐茎中固有的不均匀分布。

百慕大草匍匐中每个蛋白质的平均乙酰化和琥珀酰化位点分别为21.2（43/4657）和1914.1。这些数字与其他植物物种的结果相当。

例如，大豆叶片中每种蛋白质的平均乙酰化位点为128.2（05/3148），而奥利弗桫椤中每种蛋白质的平均琥珀酰化位点为16.1（79/653）。

值得注意的是，在百慕大草匍匐中，两种蛋白质被鉴定为具有28多个琥珀酰化位点。这一结果进一步支持了蛋白质赖氨酸乙酰化和琥珀酰化可能以不同频率存在于百慕大草匍匐中的怀疑，因为单个蛋白质的多个琥珀酰化肽很少从低效的免疫亲和富集过程中获得。

此外，氨基酸组成分析表明，酪氨酸、谷氨酸和赖氨酸经常分布在乙酰化赖氨酸位点周围，而异亮氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸经常分布在百慕大草匍匐酮琥珀酰化赖氨酸位点周围。

在其他大规模乙酰化和琥珀酰化鉴定研究中也发现了相似的氨基酸组成。例如，在 P. asperata 中，乙酰化赖氨酸位点周围经常检测到酪氨酸和赖氨酸残基，而在 C. cathayensis 和 D. officinale 中，在琥珀酰化赖氨酸位点周围经常检测到谷氨酸。

这些结果共同表明，不同的植物物种中可能存在一种保守机制，以添加和去除特定蛋白质的乙酰化和琥珀酰化修饰。

考虑到蛋白质酰基转移酶和琥珀酰基转移酶在植物中仍未鉴定，对被特定氨基酸包围的赖氨酸残基的偏向非酶修饰可能是一种可能的机制。

百慕大草匍匐中赖氨酸乙酰化和琥珀酰化蛋白的鉴定

尽管已经在几种植物物种中成功进行了大规模的乙酰基和琥珀酰基研究，但特异性乙酰化和琥珀酰化修饰的详细调控功能仅在少数植物中表征。

例如，K407和K425处的乙酰化增加了三角假单胞菌中长链酰基辅酶A合成酶的酶活性。

172个赖氨酸位点的乙酰化均降低了拟南芥中MDH蛋白的草酰乙酸还原活性，而K32处MDH蛋白的乙酰化增加了其在拟南芥中的活性。

K55的琥珀酰化降低了水稻CAT蛋白的酶活性，而K241或K10的琥珀酰化增加了水稻谷胱甘肽S-转移酶蛋白的酶活性。

在这项研究中，我们表达并纯化了wt和乙酰化/脱乙酰化模拟CAT蛋白以及wt和琥珀酰化/去琥珀酰化模拟MDH蛋白。酶法测定表明，CAT在K332处的乙酰化和MDH在K7处的琥珀酰化都降低了它们的酶活性。

考虑到这些结果是从体外纯化蛋白中获得的，乙酰化模拟CAT蛋白和琥珀酰化模拟MDH蛋白的酶活性降低可能仅由蛋白质电荷的变化引起，而脱乙酰化/去琥珀酰化模拟突变对酶活性的影响很小，因为两种蛋白质的电荷保持不变。

有趣的是，这两个修饰位点都保存在三种草的快速生长器官中。先前的研究表明，缺乏线粒体MDH蛋白的拟南芥突变植物表现出小、生长缓慢和种子发芽后生长表型受损。

而拟南芥过氧化氢酶三重突变体也表现出严重的氧化还原紊乱和生长缺陷，这意味着这两种酶在快速器官生长中起重要作用。

本研究结果进一步表明，两种酶的活性可分别通过保守乙酰化和琥珀酰化调控，为植物生长发育中的动态代谢调控提供新的思路。

我们的分析成功地鉴定了百慕大草快速生长的匍匐中的数千种赖氨酸乙酰化修饰和数百种赖氨酸琥珀酰化修饰，然而，许多乙酰化蛋白质和可能具有重要功能的琥珀酰化蛋白质可能无法确定，因为它们与亲和抗体的丰度低或反应性差。

另一方面，许多研究表明乙酰化和琥珀酰化修饰都存在于非常低的化学计量中。

此外，实验证据进一步表明，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）在拟南芥中以非常低的化学计量被乙酰化，不能有意义地影响其在体内的酶活性，乙酰化水平的适度增加不会显着改变其最大活性。

考虑到纯化的乙酰化/脱乙酰化模拟CAT蛋白和琥珀酰化/脱琥珀酰化模拟MDH蛋白只能模拟乙酰化和琥珀酰化修饰对两种蛋白质的100%和0%化学计量，两种修饰对体内酶活性的实际影响可能弱于体外酶法测定结果。

未来，我们不仅要利用最先进的质谱技术和高亲和力抗体进一步探索未知的乙酰化和琥珀酰化修饰。

还要使用同位素标记的肽标准品确定感兴趣的修饰的化学计量，以获得其实际的生物学功能。

结论

综上所述，1914年百慕大草匍匐中首次鉴定出具有4657个赖氨酸乙酰化位点的乙酰化蛋白和具有128个赖氨酸琥珀酰化位点的226个琥珀酰化蛋白。

乙酰化和琥珀酰化的蛋白质位于不同的细胞区室中，形成复杂的相互作用网络并参与不同的细胞过程。

过氧化氢酶的保守乙酰化和苹果酸脱氢酶的琥珀酰化进一步揭示了体外酶活性降低，为乙酰化和琥珀酰化介导的百慕大草斯托隆生长在生化水平上的调节提供了初步证据。

未来，利用现有的基因组资源和遗传转化技术，可以阐明百慕大草植物中特异性乙酰化和琥珀酰化修饰的详细生理功能。